盐酸水苏碱对LPS诱发的小鼠乳腺炎的保护作用

来源: www.daniulw.com 发布时间:2021-03-16 16:41
论文地区:中国 论文语言:中文 论文类型:在职硕士
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 摘  要 乳房炎是导致牛奶质量和产量大幅下降的原因,给奶业造成了严重的经济损失。近几十年来,非甾体抗炎药(NSAIDs)和抗生素作为常规药物治疗乳房炎。然而,抗生素耐药性已经成为主要的公共威胁之一。中药相比抗生素来说具有天然、安全、副作用小等特点,可减少药物残留和耐受现象的出现。已有报道称中药提取物盐酸水苏碱具有抗炎抗氧化等活性,然而其对乳腺炎是否具有保护作用还尚未见到报道。因此本研究以盐酸水苏碱为研究对象,进行了急性毒性试验和体外抑菌试验,并通过构建LPS诱发的小鼠乳腺炎模型来评价其对乳腺炎的防治效果,为其进一步开发利用提供数据参考。

  本研究采用小鼠急性毒性实验方法,探讨盐酸水苏碱小鼠腹腔给药的安全性,进行盐酸水苏碱对小鼠腹腔注射给药的半数致死量(LD50)测定,连续观察7 d。同时,采用琼脂稀释法检测最小抑菌浓度(MIC)研究了盐酸水苏碱对乳腺炎常见病原体大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果。建立LPS诱发的小鼠乳腺炎模型,观察其大体解剖学变化,通过HE染色方法检测乳腺组织的病理组织学变化,利用试剂盒检测乳腺组织中MPO活性以及氧化应激指标T-SOD、GSH、MDA、NO的水平,利用酶联免疫吸附测定(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)试剂盒检测血清炎细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6的蛋白水平。
  
  安全性结果显示,盐酸水苏碱的LD50剂量为1565.442 mg/kg,其95%可信区间为1440.781~1711.356 mg/kg,存活小鼠解剖观察心脏、肝脏、肾脏、脾、肠道等无无明显病理变化。体外抑菌试验结果表明盐酸水苏碱对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的MIC均为10 mg/kg。盐酸水苏碱对小鼠乳腺炎保护作用试验结果显示,盐酸水苏碱改善了乳腺炎造成的乳腺组织充血坏死以及乳汁蓄积状况,使腺泡壁变薄,炎性浸润减少,降低了MPO活性及促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表达水平,同时显着升高了T-SOD、GSH含量,降低了MDA和NO的含量。
  
  综上所述,盐酸水苏碱有一定毒性并具有抑菌活性,能够通过降低促炎因子水平、提高抗氧化能力来发挥对小鼠乳腺炎的保护作用。
盐酸水苏碱对LPS诱发的小鼠乳腺炎的保护作用
  
  关键词:     盐酸水苏碱;急性毒性;抑菌;乳腺炎;抗炎;抗氧化。
  

  ABSTRACT

  
  Mastitis is the cause of significant decline in milk quality and production, and has brought serious  economic  loss  to  the  dairy  industry.  In  recent  decades,  non-steroidal  anti-inflammatory drugs (NSAIDs) and antibiotics have been used for the treatment of mastitis as conventional drug therapy. However, antibiotic resistance has become one of the major public  health  threats.  Compared  with  antibiotics,  traditional  Chinese  medicine  has  the features like natural, safe, less side effects, etc., which can reduce the occurrence of drug residue and tolerance. It has been reported that stachydrine hydrochloride, the extract of traditional Chinese medicine, has anti-inflammatory and anti-oxidant activities, but whether it has a protective effect on mastitis has not been reported. Therefore, in this experiment, stachydrine hydrochloride was used as the research object to study its safety and antibacterial effect through toxicological test and in vitro bacteriostasis test, and to explore its protective effect on mastitis in mice by constructing a mouse mastitis model induced by LPS, in order to  provide  data  reference  for  the  further  development  and  utilization  of  stachydrine hydrochloride.
  
  In this study, the acute toxicity test method of mice was used to explore the safety of intraperitoneal administration of stachyine hydrochloride in mice, and the median lethal dose (LD50) was determined after 7 consecutive days. The minimum inhibitory concentration (MIC)  was  tested  by  agar  dilution  method  to  study  the  antibacterial  effect  of  stachyine hydrochloride  on  Escherichia  coli  and  Staphylococcus  aureus,  common  pathogens  of mastitis. A model of LPS-induced mouse mastitis was established to observe its general anatomical changes. Besides the histopathological changes of breast tissue was observed by HE staining method, the MPO activity and levels of oxidative stress indicators T-SOD, GSH, MDA and NO in breast tissue were detected, and the levels of serum inflammatory cytokines TNF-α, IL-1β and IL-6 were detected by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kits.
  
  Results of the acute toxicity test showed that the LD50 dose of stachyine hydrochloride was 15654.42 mg/kg, and its 95% confidence interval was 1440.781 ~ 1711.356 mg/kg. Surviving  mice  were  dissected  to  observe  heart,  liver,  kidney,  spleen,  intestine  and  no obvious  pathological  changes  was  observed.  The  results  of  bacteriostasis  tests  in  vitro showed  that  the  MIC  of  stachyine  hydrochloride  against  Escherichia  coli  and Staphylococcus  aureus  were  both  10  mg/kg. The  test  results  of  the  protective  effect  of stachylamine hydrochloride on mastitis in mice showed that stachylamine hydrochloride improved the congestion and necrosis of breast tissue and milk accumulation caused by  mastitis, thinned the acinar wall, reduced the inflammatory infiltration, the MPO activity, and the expression levels of pro-inflammatory factors IL-1β, IL-6 and TNF-α, significantly increased the levels of T-SOD and GSH, and reduced the levels of MDA and NO.
  
  In summary, stachyine hydrochloride has some toxicity and has bacteriostatic activity. It can play a protective role in mastitis  mice by reducing the level of pro-inflammatory factors and improving antioxidant capacity.
  
  Keywords:     stachydrine  hydrochloride;  acute  toxicity;  bacteriostatic;  mastitis;  anti-inflammatory; oxidation resistance。
  

  文献综述

  
  1、奶牛乳腺炎的研究进展。
  
  奶牛因病原微生物入侵、机械损伤和物理化学等刺激而导致乳房实质和间质发生的炎性变化称为奶牛乳腺炎,其特点是感染部位的免疫细胞募集增加了体细胞计数(SCC),断裂的乳腺上皮细胞(MEC)紧密连接增加了牛奶中的钠含量[1],产奶量减少,全世界每年因乳腺炎导致的损失高达几百亿美元,已被认为是奶业最严重、最昂贵的疾病之一。由于过多的细菌刺激引起的乳腺炎有多种形式[2],从急性临床性乳腺炎到慢性亚临床性乳腺炎。临床型乳房炎会导致乳腺肿胀、发红和发热,并伴有血管扩张,对患畜来说通常是痛苦的,而隐性乳房炎通常没有症状,但最终仍会导致产奶量减少。对于具有明显临床症状的临床型乳腺炎较容易诊断,可及早给出治疗,而隐性乳腺炎由于缺乏典型病症,较难诊断,需要实验室诊断来分离和鉴定所涉及的病原体,而患病奶牛哺乳期甚至一生都会感染或威胁生命。虽然有的奶牛仍然可以产奶,但牛奶的品质及产量均受到影响,作为食源性产品的牛奶,产品产量及质量与人们的生活和身体健康息息相关,并且巨大的经济损失也严重限制了养殖业的发展,其中78%的经济损失是由于牛奶产量减少,另外8%的经济损失来源于治疗费用,剩余14%的经济损失来源于扑杀[3]。在乳腺炎被人类认识的上百年来,科学家们一直不断研究,我国认识该病时间较晚,虽有一定的研究但并没有完整彻底解决该病发生与治疗。现今我国仍然以抗生素为主要治疗原则,而抗生素所引起的细菌耐药性是生产过程及往后治疗的一大障碍,牛奶中会存留抗生素残留物,这对消费者的健康是有害的,这些年来,抗生素这种常规治疗方法似乎显得缓慢而不足[4]。因此,我们仍要努力寻找安全高效的药物来防止奶牛乳腺炎,保证养殖业稳步发展,提高人民生活水平。
  
  1.1、奶牛乳腺炎病因。
  
  乳腺炎的发生因素极其复杂,包括入侵的病原体和宿主因素,如哺乳期、年龄、奶牛的免疫状态、遗传和营养状况、动物本身的应激、环境因素、饲养管理等相互作用,而奶牛乳腺炎发生的主要因素是病原微生物的感染[5],临床上现已分离鉴定出130余种可导致乳腺炎的致病菌[6]。传染性致病菌多由挤奶操作不规范引起传播,致病菌定植于乳腺上皮细胞或吞噬细胞中,引起无明显症状的乳腺炎并逐渐发展成慢性乳腺炎[7],以大肠杆菌为主的环境性致病菌所引起的乳腺炎通常具有明显的全身症状,这些致病菌通常隐藏在奶牛皮肤的褶皱中,通过开放的乳导管进入乳腺中繁殖,从生理和经济角度看,细菌性乳腺炎是最常见和最重要的[2]。因此,对以下三种主要引起感染的病原菌作了简单介绍。
  
  1.1.1、金黄色葡萄球菌。
  
  金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus, S. aureus)为革兰氏阳性兼性厌氧菌,可通过乳导管进入乳腺并爆发性感染,通常在6小时内就会引起乳区急性坏疽使乳腺坏死,严重可能导致败血症威胁生命[8]。因为其容易传播,流行迅速,菌株变异快,善于逃避宿主免疫系统,除奶牛自身会感染发病外,金黄色葡萄球菌还会随着乳汁分泌感染其他奶牛[9]。金黄色葡萄球菌菌体结构复杂,包括多种毒素和侵袭性酶,细菌在荚膜多糖的抗吞噬作用下不被吞噬细胞吞噬,利用粘附素在乳腺上皮细胞和吞噬细胞中定植,进一步产生毒素和酶破坏宿主细胞,使得感染难以控制[10]。另外,从公共卫生角度看,作为人兽共患菌,若乳制品含菌量超标,将严重影响人们的健康安全。
  
  1.1.2、大肠杆菌。
  
  大肠杆菌(Escherichia coli, E. coli)是革兰氏阴性菌,在牛群里广泛分布,该菌除从乳导管感染外,也会通过损伤的生殖道进入血循环或淋巴感染乳区[11],大肠杆菌释放细菌细胞壁成分—脂多糖(LPS),诱导局部炎症介质显着增加,具有强烈的全身急性时相反应。越来越多的证据表明,LPS是最有效的触发炎症反应的微生物启动者,通过乳腺上皮细胞凋亡来减少产奶量,并增加牛奶体细胞计数(SCC)。有研究表明[12],乳房内免疫反应可能是由革兰氏阴性菌诱导的Toll样受体(TLR)信号转导引起。除了乳房炎的高炎症反应外,持续或过度的炎症还会诱导内皮细胞凋亡,可能导致组织损伤甚至死亡[13]。
  
  1.1.3、链球菌。
  
  链球菌有许多分类,其中以无乳链球菌为主要致病菌,无乳链球菌(Streptococcusagalactiae,GBS)革兰染色呈阳性,是具有高度传染性的专一乳腺内寄生菌,奶牛感染后通常无明显临床症状,一般不会引起乳腺组织纤维化或者脓肿,主要导致乳腺萎缩,表现为产奶量下降,牛奶中SCC升高[14]。
  
  
  1、引言
  
  2、材料与方法
  
  2.1.1、动物
  2.1.2、仪器
  2.1.3、菌种
  2.1.4、试剂
  2.2、方法.
  2.2.1、腹腔注射盐酸水苏碱的急性毒性试验
  2.2.2、盐酸水苏碱的体外抑菌试验
  2.2.3、盐酸水苏碱对LPS诱导的小鼠乳腺炎的保护试验
  2.2.4、统计学方法
  
  3、结果与分析
  
  3.1、急性毒性试验.
  3.1.1、预试验
  3.1.2、正式试验
  3.2、体外抑菌试验.
  3.3、小鼠乳腺大体解剖和病理组织学观察
  3.4、盐酸水苏碱对MPO活性的影响
  3.5、盐酸水苏碱对促炎因子表达.影响
  3.6、盐酸水苏碱对氧化应激指标的影响
  
  4、讨论
  
  4.1、急性毒性试验.
  4.2、 盐酸水苏碱体外抑菌试验
  4.3 、盐酸水苏碱对 LPS 诱导小鼠乳腺炎的保护作用

  5、  结 论

  5.1、腹腔注射盐酸水苏碱的LD50剂量为1565.442  mg/kg,其95%可信区间为1440.781~1711.356 mg/kg,说明盐酸水苏碱具有一定毒性。

  5.2、盐酸水苏碱在浓度为10 mg/kg时能抑制引起乳房炎的主要致病菌大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长,说明具有一定的抑菌活性。

  5.3、盐酸水苏碱能够减轻乳腺的病理损伤,降低髓过氧化物酶活性,并通过抑制炎症过度表达和提高抗氧化能力来预防LPS诱发的小鼠乳腺炎。
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